臭氧對營養菌和孢子菌的滅活作用研究

不同類型微生物的氣態臭氧滅活是成（chéng）功地實現的，眾所周（zhōu）知，隻要氣相被強烈加（jiā）濕。然而，這一（yī）過程中涉及的失活機製和物種尚未明（míng）確確定（dìng）。為了深入了解，我們考慮將細菌孢子暴露在幹燥而不是潮濕的臭氧中，這是（shì）一種不太複（fù）雜（zá）的（de）化學環境。與大多數已發表的（de）文獻相反，研究表明，在嚴格的幹燥臭氧條件下，細菌孢子（zǐ）可以滅活，但滅活程度在很（hěn）大程度（dù）上取決於孢子類型和（hé）底物材（cái）料。在這種情況下，由於沒有檢測到孢子的外部侵蝕，因此確定O3分（fèn）子通過其擴散到孢子內並在孢子內氧化作用來負責失活過程。

使（shǐ）用（yòng）加濕臭氧，觀察（chá）到較高的失活效率，這很可能部分與孢（bāo）子的膨脹ling有關，這有助（zhù）於氧化物質在其內（nèi）部擴（kuò）散並一直擴散到核心;除O3外，這些氧化（huà）劑（jì）源於O3與H2O的相互作用，很終導致孢子結構嚴重受（shòu）損，而與幹臭（chòu）氧暴露相比，孢子完整性得（dé）以保持。

以（yǐ）往（wǎng）工作回顧

從一開始以及此後相當長的一段時間內，在環境空氣中使用臭氧作為氣（qì）態殺菌劑的濃度（dù）水平被限製在（zài）接近1ppm的水平(事實上，就人體毒性而言，0.1 ppm被確定為占用(每周40小（xiǎo）時)很大安全值)。

Elford和Van de Eude(1942)在已知溫度和相對濕度（dù）(RH)值的房間中對氣溶膠化（huà）細（xì）菌懸浮液進行了研（yán）究，他們確定在60-80% RH的房（fáng）間中，臭氧濃度超過1ppm是相（xiàng）對於幹燥環境（jìng）的更好條件。

Kowalski等人（rén）(1998)研究了空氣中高濃度臭氧對大腸（cháng）杆菌和金黃色葡萄球菌營養細菌的影響。

將（jiāng）微生物暴（bào）露（lù）於空氣中濃度（dù）為300至1500 ppm、相對濕度為18-20%的臭氧（yǎng）中10至480秒:在1500 ppm和8分鍾（zhōng）內，兩種微生物的死亡率均超過99.99% (>4 log)。

依靠幹（gàn）氣體臭氧，但濃度要高得（dé）多（duō），Held研究了醫院廢物的淨化(Held, 2002;Coronel等人，2002年)，由革蘭氏陽性和革蘭氏陰性的營養細菌、真菌、分枝杆菌和孢（bāo）子細菌(如萎（wěi）縮芽孢杆菌、嗜脂嗜熱（rè）地杆菌和產氣莢膜梭（suō）菌)組（zǔ）成。測試了從幹空氣電暈放電中（zhōng）獲（huò）得的臭氧濃度為10,000-12,000 ppm。

該係統（tǒng）允許超過107個營養細菌/mL的（de）失活(金（jīn）黃色葡萄球菌，萎縮杆菌，大腸杆菌…)

暴露1小時內，處（chù）理2小時後孢子數超過107個/mL。

Ishizaki等人(1986)研究了臭氧濃度在250至1500 ppm(0.5至3 mg/L)範圍（wéi）內的氣態臭氧對不同芽孢杆菌孢子的殺孢活性，並著重研究了相對濕度水平的（de）影響。

在50%或更低的相對濕度下，暴露6小時後，存活（huó）的數量沒有明（míng）顯減少。

然而，在較（jiào）高的RH值下，在不到2小時的時間內達到了5對數（shù）的降低，這一點（diǎn）後來被Currier等人(2001)證實。

Aydogan和Gurol(2006)的結果還表明，在70-95%相對濕（shī）度的條件下，將O3濃度從1 mg/L增（zēng）加到3 mg/L，可以提高孢子的失活率（lǜ），但超過3 mg/L (1500 ppm)時，隻觀察到微弱的額外增加。

從前麵（miàn）的作品（pǐn）中可以看出三點:

(i)臭氧濃度越高，相對濕度越高（gāo）(0.50%)，滅活過程越（yuè）有效。

事實上，在某些情況下，濕度是絕對需要的，以達到無（wú）菌，如（rú）TSO3的情況

TM滅菌係統，由加拿大衛生部和FDA(美（měi）國食品藥品管（guǎn）理局)批準;

(ii)加濕的氣態（tài）臭氧相對於幹的氣態臭氧作為（wéi）殺生劑的附加（jiā）值肯定是在幹臭氧條件下幾乎沒有工（gōng）作的部分原因（yīn）(Ishizaki et al.， 1986);

(iii)然而，根據文獻尚未嚴格確定臭（chòu）氧過程中涉及的失活機製和物種。

臭氧暴露下可能的失活機製綜述

強氧化劑通常能（néng）夠化學攻擊微生物的成分，即蛋白質、不飽和脂質、革蘭氏陰性細菌的脂（zhī）多糖層、細胞內酶(如呼吸酶)和核酸(遺傳物質)，以及孢子外殼和病毒衣殼中的蛋白質和肽聚糖(Tseng和Li, 2008)。

營養細（xì）菌

臭氧使營養細菌失（shī）活是一個複雜的過程，因為臭氧會破壞營養細菌的（de）大量成分;然而，O3被認為主要引起細（xì）菌細胞壁和細胞質膜上的蛋（dàn）白質和（hé）脂質氧化（huà）。這些結構的逐漸降解涉及到滲透（tòu）性和細胞完整性的改變，並且通常伴隨著細胞裂解(Broadwater et al.， 1973;Kim and Yousef, 2000;Khadre and Yousef, 2001;Thanomsub et al.， 2002)。

沿著這條線（xiàn），Kim和Youssef(2000)觀察到革蘭氏陰性菌(大腸杆菌…)的損害（hài）更為明顯。可能是因（yīn）為它們的脂多糖層比革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌（jun1）…)(Komanapali and Lau, 1998;Komanapali and Lau, 1996)。Hunt和（hé）Marinas(1999)基於透射（shè）電子（zǐ）顯微鏡(TEM)顯微照片對（duì）細菌失活提出了不同的解釋:他們（men）觀察到臭氧處理後大腸杆菌的類核（hé）收縮。這些作者得出結論，O3能夠穿透細（xì）胞，並與（yǔ）細胞中的蛋白質或許多酶發生反應，這些酶參與（yǔ）控製DNA con的形成，從而導致其錯誤折疊。

細菌（jun1）孢子

研究細菌孢子的主要興趣在（zài）於（yú）它們是耐藥的微生物，正因為如此，官方要求驗證（zhèng）滅菌過程（chéng）。細（xì）菌孢子可以經受嚴酷的處理，包括熱、輻照、化學藥品和幹燥。芽孢杆菌種類的細菌孢子已被證明對（duì）臭氧特（tè）別敏感 (Kowalski et al.， 1998)，因此被用於本研究。人們先驗地認為，細菌材料孢子受臭氧的影響比營（yíng）養細（xì）菌小（xiǎo），因（yīn）為它們具有多層保護和（hé）抗逆性。文獻中已（yǐ）經提出了誘（yòu）導孢（bāo）子致死的各種O3靶點，下麵我們將詳（xiáng）細介紹（shào）。

酶

一些作者認為酶損傷是O3殺死細胞的重要失活機製(Hinze et al.， 1987;Takamoto et al.， 1992)。Young和Setlow(2004)表明，與野生型孢子相比，缺乏某種酶（méi）(第（dì）二皮層裂解酶(SleB))的萎縮芽（yá）孢杆（gǎn）菌突變孢子被O3滅活的（de）速度更快(Khadre和Yousef, 2001;Young and Setlow, 2004)。此外，Takamoto等人(1992)觀察到，臭氧在不同程度上降（jiàng）低了大腸杆菌（jun1）中酶的活性，這取（qǔ）決於所考慮的酶的具體性質。

DNA。它也可能是一個靶標，因為O3與核堿（jiǎn）基反應迅速（sù），尤其是（shì）胸腺嘧啶、鳥嘌（piào）呤和（hé）尿嘧啶(Ishizaki et al .， 1986;Swadeshi et al.， 1986)。相反，像Young和（hé）Setlow(2004)這樣的作者聲稱水中的臭氧（yǎng）不會通過DNA損傷殺死孢子。在這裏，水（shuǐ）中的O3在100% RH的環境中被同化為臭氧。孢子的外套。孢子被（bèi）毛是指，從（cóng）孢子很外層開始，表層，然後是外被毛和內被毛。再往裏看，有皮層，內膜和包含DNA的核心（xīn）。孢子（zǐ）外殼約（yuē）占孢子體積的50%，包含約80%的（de）孢子蛋白質，因此構成代謝功能（néng）損（sǔn）傷的屏障(例如酶)。

孢子對殺（shā）菌劑（jì）產生（shēng）抗性的主要因素似乎是孢子（zǐ）的外（wài）殼(Komanapali和Lau, 1996;Young and Setlow, 2004)。Kim等人(2003)的TEM顯微照片也支持了這一觀（guān）點，在（zài）水氧化處理的情況（kuàng）下，TEM顯微照片顯示（shì）了對表層以及外層和內層的損（sǔn）害。這種損傷（shāng）為O3在皮層上的作用（yòng）開辟了道路，很（hěn）終通（tōng）過細胞內損傷導致孢子失活(Kim et al.， 2003;Young and Setlow, 2004)。

此外，Foegeding(1985)發現，蠟樣芽孢杆菌的外殼蛋白被（bèi）去除後，在（zài）水溶（róng）液中（zhōng）比完整的孢子更快地失活:他（tā）們得出結論，孢子的外殼是對抗O3分子的主（zhǔ）要保護（hù）屏障。更廣泛（fàn）地說，化學脫去的孢子（zǐ）和外殼有（yǒu）缺陷的孢（bāo）子(結果來自主要外殼形成蛋白cotE的突變)被水溶液O3殺（shā）死（sǐ）的速度要比外殼完整的孢子快得多(Young和（hé）Setlow, 2004)。這使得Young和Setlow(2004)得出結論，孢子外殼(特別是在萎縮芽孢杆菌孢子中)在（zài）孢子對O3的抗（kàng）性中是必不可少的。膜（mó）也會被氧（yǎng）化劑破壞，包括O3 (Cortezzo et al.， 2004)。很近的研究結果表明（míng），孢（bāo）子內膜可能（néng）是O3致死（sǐ）性損傷的部位，因（yīn）為受損的內膜:

(i)阻止孢（bāo）子在（zài）正常模式高溫熱處理或其萌發形式麵臨滲透脅（xié）迫時保持（chí）完整性;

(ii)因為它變得更具有滲透性。Cortezzo等人(2004)進一（yī）步研究發現，氧（yǎng）化劑對（duì）孢子內膜的破壞也與觀察到的甲胺更（gèng）快地滲（shèn）透到處理過（guò）的孢（bāo）子核心一致:內膜可能是甲（jiǎ）胺進入孢（bāo）子核心的關鍵滲透性屏障。這一（yī）滲（shèn）透性屏障的破裂可能導致孢子核心內容物的釋放（fàng）(Khadre和（hé）Yousef, 2001;Young and Setlow, 2004)。

為了深入了（le）解（jiě）臭氧暴露後微生物（wù）的（de）失活機製，我們首先使用幹燥的氣態臭氧，這是一個比潮（cháo）濕的（de）氣（qì）態臭氧更不複雜的化學環境:

在（zài）氣態臭氧中加入水蒸氣（qì）會帶來額外的氧化劑，使確定它們的相（xiàng）對貢獻和確定（dìng）失活機製變得更加困難。本文通過存活曲線研（yán）究了細（xì）菌孢子在嚴格幹燥（zào）臭氧條件下的inac活（huó）化動力學，並利用掃描電鏡 (SEM)檢查了相應的損傷。還介紹了暴露於加濕臭氧的孢子的這種特征數據。利用文獻資料，對這（zhè）兩組實驗結果(幹臭氧和濕臭氧情況)進行密切（qiē）的（de）“不同”分析，使我們能夠提出一幅新的更（gèng）詳細的圖片，說（shuō）明（míng）細菌孢子在臭氧作用下的失活機製。

材料與方法

由於（yú）臭氧具有（yǒu）很強的氧化能力，它能或多或少地破壞（huài）各種材料。為了盡量（liàng）減少這種可能的影響，這可能會幹擾我們的實驗，滅菌室（shì）由316不鏽（xiù）鋼製成(要求承受加濕臭氧（yǎng）)，用於光譜觀察的窗戶（hù）由熔融二氧化矽製成（chéng）。待調查的微生物沉積在由聚苯乙烯（xī）(幹臭氧暴露)或耐熱玻璃(濕臭氧暴露)製成的培養皿上。

臭（chòu）氧化係統（tǒng）

圖1顯示了用於產生臭氧並在（zài）臭氧進（jìn）入和（hé）離開腔室時（shí）測定其濃度的係統的各種元件。

該腔室由316不鏽鋼製成，是一個400毫米（mǐ）長，100毫米高，220毫米（mǐ）寬的平行六麵體(6升體積)。

臭氧濃度可以用基於紫外線吸收（shōu）的分析儀來監測。

生成的廢水也可以通過FTIR光譜進行分析（xī）:來自（zì）Thermo Nicolet的Avatar 370光譜儀使用DTGS (7800-375 cm-1)探測（cè）器，掃描次數和分（fèn）辨率分別設置為80和1 cm-1。

臭氧（yǎng）發生器在氣相中提供分（fèn）子氧和原子氧的混合物;

它在電流範圍內工作，在電流範圍內增加臭氧濃度。

臭氧流是幹燥的，因為發（fā）生器（qì）是由（yóu）(高純度（dù）)O2幹氣瓶（píng）提供的。

本文（wén）所用的“幹臭氧”一詞是指相對濕度(RH)小於約2%(用（yòng）濕度計測定)的氣態臭氧。

總氣（qì）體流（liú）量（liàng）設（shè）定為5.64標準升/分鍾(slm)，在幹燥條件下實現（xiàn）臭氧（yǎng）濃度為4,000 ppm。

在工藝線的末端安裝了一個臭氧（yǎng）破（pò）壞（huài）者，用於減少臭氧並將其作（zuò）為（wéi）O2釋放（fàng），以符合安全(毒性)法規。

出於安全考慮，該腔室也（yě）位於通風櫃內，並連（lián）接了真空幹泵，以確保在過程（chéng）結束時腔室流（liú）出物被完全排出。

在（zài）使用加濕（shī）臭氧的過程中可以（yǐ）加入水（shuǐ）蒸氣。

水通過蠕動泵送到“烤箱”(加熱器)，產生的蒸（zhēng）汽被進入（rù）的O2氣流驅動到O3管線。

在給定的（de）加熱（rè）器溫度和給定的O2流量下，注入的水蒸氣（qì）量（liàng）取決於蠕動泵設定的H2O流量。

在單獨（dú）存（cún）在O2的情況下，用濕（shī）度計(Kahn, Wethersfield, CT, USA)測定腔內相應（yīng）的（de）RH水平(RH可精確測（cè）量至少95%(0.3%))。

在加濕（shī）條（tiáo）件下，總氣體流量設置（zhì）為2.6 slm，以實現約4 000 ppm的臭氧濃度。

腔內（nèi）氣體溫度保持接近環境溫度(≈22℃)。

總（zǒng）結（jié）與結（jié）語

了解暴露於加濕（shī）氣體臭（chòu）氧導致的（de）微生物失活機製是一項複（fù）雜而艱巨（jù）的任（rèn）務（wù）。我們的方法是，在嚴格的幹燥氣體臭氧暴露(RH, 2%)下，檢查三種生物指示孢子和一種細（xì）菌的失（shī）活動力學和形態損傷，然後考慮濕化氣體臭氧暴露的情況:很後，將這兩項研究的結（jié）果相關聯，有助於揭示各種失活機製。

在（zài）幹燥（zào）的氣態臭（chòu）氧暴露下，我們已經證明O3分子可以有（yǒu）效（xiào）地滅活某些類型的孢子(G. stearothermophilus)，而其他類型的孢子(B. atrophaeus)則更少，滅活（huó）率的差異可能在於其成分的性質或排列，本質上是其外殼(和內膜)的化學成分（fèn）。孢子的形態不受（shòu）幹臭氧處理的（de）影響，這意味著擴散/氧化，而不（bú）是侵蝕，與O3分子的作用有關，這些分子在孢子內移（yí）動。

此外，我們還表明，沉（chén）積在不同聚合物基質上的孢子的臭氧滅活效果取決於聚合物的性質。

在（zài）加濕（shī）的氣態臭氧暴露下（xià），我們認（rèn）為一（yī）個重要（yào）的初始機製(在殺生物作用之前)是孢子的水膨脹，這打（dǎ）開了“通（tōng）道”，促進了殺生物劑的（de）內部擴散（sàn）。

這些是O3分子及其（qí）與H2O相互作用的副產（chǎn）物，產生高度氧化的物（wù）質，如HO.2, OH。過氧化氫。這些氧化過程的很終結果（guǒ）是（shì）在一定程度上（shàng）抵抗幹臭氧作用的孢子(b.s atrophaeus)失活，在足夠長的暴露（lù）時間後，這裏使（shǐ）用（yòng）的所有三種生物指示劑都（dōu）被嚴重破壞，甚至粉碎。O3分子和（hé）氧化自由（yóu）基對（duì）濕化臭氧失活過程的相（xiàng）對貢獻可以在未來的工作（zuò）中確定。下（xià）一步可能（néng）是呼籲分子生物學來（lái）評估孢子核酸所遭受的損害的種類和（hé）程度。

正在進行涉及（jí）臭氧和表麵淨化的進一步（bù）工作（zuò）。它（tā）涉及的事實是，通過將某些聚合物置於幹燥的臭氧流(通常為4000 ppm 1小時)中，可以賦（fù）予其生物（wù）殺滅性能。然後，當在這（zhè）些（xiē）處（chù）理過的表麵上沉積細菌孢子時，同（tóng）一天或2-3天後，並讓它們幹燥24小時，觀察到初始種群減少3到5對數(Mahfoudh等人，2010;Mahfoudh et al.， 2010)。