臭氧對營養菌和孢子菌的（de）滅活作用研究

不同類型微生物的氣態臭（chòu）氧滅活是（shì）成功地實現的，眾所周知，隻要氣相被強烈加濕。然而，這一（yī）過程中涉及的失活機（jī）製（zhì）和物種尚未（wèi）明確確定。為了深入（rù）了解，我們（men）考慮（lǜ）將細菌孢子暴露（lù）在幹（gàn）燥而不是潮濕的臭氧中，這是（shì）一種不太複雜（zá）的化學環境。與大多數已發表的文獻相反，研究表明，在嚴格（gé）的幹燥臭（chòu）氧條（tiáo）件下，細菌（jun1）孢子可以滅活，但滅（miè）活程（chéng）度在很大程度上取決於孢子類型和底物材（cái）料。在這種情況下，由於沒有檢測到孢子的外部侵蝕，因此確定O3分子通過其擴散到孢子內並在孢子內氧化作用來負責失活過程。

使（shǐ）用加濕（shī）臭氧，觀察到較高的失活效率，這很可能部分與孢子的膨脹ling有關（guān），這有助於氧化物質在其內部擴散並一直擴散到核心;除O3外，這些氧化劑源於O3與H2O的相互作用，很終導致孢子結構嚴重受損，而與幹（gàn）臭氧暴露相比，孢子完整性得以保持。

以往工作（zuò）回顧

從一開始以及（jí）此後相當長的一段時間內，在環境（jìng）空氣中使用臭氧（yǎng）作（zuò）為氣態殺菌劑的濃度水平被限製在接近1ppm的水（shuǐ）平(事實上，就人（rén）體毒性而（ér）言，0.1 ppm被確定為占用(每周40小時)很大安全值)。

Elford和Van de Eude(1942)在已知溫（wēn）度和相對濕度(RH)值的房間中對氣（qì）溶（róng）膠化細菌懸浮（fú）液進行了（le）研究，他們確定在60-80% RH的房間中，臭氧濃度超過1ppm是相對於幹燥環（huán）境的更好條件。

Kowalski等人(1998)研究了空氣中高濃度臭氧對（duì）大腸杆菌和金黃色葡萄球菌營養細菌的影響。

將（jiāng）微生物暴露於空（kōng）氣中濃度（dù）為（wéi）300至1500 ppm、相對濕度為18-20%的臭氧中10至480秒（miǎo）:在1500 ppm和8分鍾內，兩種微生物的死亡率均超過99.99% (>4 log)。

依（yī）靠幹氣體臭氧，但濃度要高得多，Held研究了醫院廢物的淨化(Held, 2002;Coronel等人，2002年)，由革蘭氏陽性和革蘭氏陰性的營養細菌、真菌（jun1）、分（fèn）枝杆菌和孢子細菌(如萎縮（suō）芽孢杆菌、嗜脂嗜（shì）熱地杆（gǎn）菌和產氣莢膜梭菌)組成（chéng）。測試了從幹空氣電暈放（fàng）電中獲得的臭氧濃度為10,000-12,000 ppm。

該係統允許超過107個營養細菌/mL的失活(金黃色葡萄（táo）球菌，萎縮杆菌，大（dà）腸杆菌…)

暴露1小時（shí）內，處理2小時後孢子數超過107個/mL。

Ishizaki等人(1986)研究了臭氧濃度（dù）在250至1500 ppm(0.5至3 mg/L)範圍內（nèi）的（de）氣態臭氧對不同芽孢杆菌孢子的殺孢活性，並著重研究了相對濕度水平的影響。

在（zài）50%或更低的相對濕度下，暴露6小時後，存活的數量（liàng）沒有（yǒu）明（míng）顯減少。

然而，在較高的RH值下，在不到2小時（shí）的時間內達到了5對數的降低，這一點後來被Currier等（děng）人(2001)證實。

Aydogan和Gurol(2006)的結果還表明，在（zài）70-95%相對濕度的條件下，將O3濃（nóng）度從1 mg/L增加到3 mg/L，可以提高孢子的失活率，但超過3 mg/L (1500 ppm)時，隻觀察到微弱的額外增加。

從前麵的作品中可以看出三點:

(i)臭氧濃度越高，相對濕度越高(0.50%)，滅活過程越（yuè）有效。

事實上（shàng），在某些情況下，濕度是絕對需要的，以達到無菌，如TSO3的情況（kuàng）

TM滅菌係統，由加拿（ná）大衛生（shēng）部和FDA(美國食品藥品管理局)批準;

(ii)加濕的氣態臭氧相對於幹的氣（qì）態臭氧作為殺生劑的附加值肯定是在幹（gàn）臭氧條件（jiàn）下幾乎沒有工作的部分原因（yīn）(Ishizaki et al.， 1986);

(iii)然而，根據文（wén）獻尚未嚴格確定臭氧過程中涉及的失活機製和物種。

臭氧暴（bào）露下可能的（de）失活（huó）機製綜述

強氧化劑通常能夠（gòu）化（huà）學攻擊微生物（wù）的成分，即蛋白質、不飽（bǎo）和脂質、革（gé）蘭氏（shì）陰性細菌的脂多糖層（céng）、細胞內酶(如呼吸酶)和核酸（suān）(遺傳物質（zhì）)，以及孢子（zǐ）外殼和病（bìng）毒衣殼中的蛋白質和肽聚糖(Tseng和Li, 2008)。

營養細菌

臭氧使（shǐ）營養細菌失活（huó）是一個複雜的過程（chéng），因（yīn）為臭氧會破壞營養細菌的大量成分;然（rán）而，O3被認為主要引起細菌細（xì）胞壁和細胞質膜上的蛋白質（zhì）和脂質氧化。這些結構的逐漸降解涉及到（dào）滲透性和細（xì）胞完整性的改變，並且通常伴隨著細胞裂解(Broadwater et al.， 1973;Kim and Yousef, 2000;Khadre and Yousef, 2001;Thanomsub et al.， 2002)。

沿著這條線，Kim和Youssef(2000)觀察到革蘭氏陰性菌(大腸杆菌…)的損害更為明顯（xiǎn）。可能是因為它們（men）的（de）脂多糖層比革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌…)(Komanapali and Lau, 1998;Komanapali and Lau, 1996)。Hunt和Marinas(1999)基於透射電子顯微鏡(TEM)顯微（wēi）照片對細菌（jun1）失活提出（chū）了不同的解釋:他們觀察到臭氧處理後大腸杆（gǎn）菌的類核收縮（suō）。這些作者得出結論，O3能夠穿透細胞，並與細胞中的蛋（dàn）白質或許多酶（méi）發生反應，這些酶參與控製DNA con的形成，從而導致其錯誤折疊。

細菌孢子

研（yán）究細菌孢（bāo）子的主要興趣在於它們是耐藥的微生物，正因為如（rú）此，官方要求驗證滅菌過程。細菌孢子可以經受嚴酷的處理，包括熱、輻照、化學（xué）藥品和幹燥。芽孢杆菌種類的細菌孢子已被證明對臭氧特別敏感 (Kowalski et al.， 1998)，因此被用於本研究。人們先驗地認為，細菌材料孢子（zǐ）受臭氧的影響比營養（yǎng）細菌小，因為它們具有多層保護和（hé）抗逆性。文獻中已經（jīng）提出了（le）誘導孢子致死的各種O3靶點，下麵我們將詳細介紹。

酶

一些作者認為酶損（sǔn）傷（shāng）是O3殺死細胞（bāo）的重要失活機製(Hinze et al.， 1987;Takamoto et al.， 1992)。Young和Setlow(2004)表明，與（yǔ）野生型（xíng）孢子相比，缺乏（fá）某種酶(第二皮（pí）層裂解酶(SleB))的萎縮芽孢杆菌突變孢（bāo）子被O3滅活的速度更快(Khadre和Yousef, 2001;Young and Setlow, 2004)。此（cǐ）外，Takamoto等（děng）人(1992)觀察（chá）到，臭氧在不同程度上降低了大腸杆菌（jun1）中酶的活性，這取決於所考慮的酶的具體性質。

DNA。它（tā）也可能是一個靶標，因為O3與核堿基反應迅速，尤其是胸腺嘧啶、鳥（niǎo）嘌呤和尿嘧啶(Ishizaki et al .， 1986;Swadeshi et al.， 1986)。相反（fǎn），像Young和Setlow(2004)這樣的作者聲稱水中的（de）臭氧不會通過DNA損傷殺死孢子。在這裏，水中的O3在100% RH的環境中被同化為臭氧。孢子的外套。孢子被毛是指，從孢子很外層開始，表層，然（rán）後是外被（bèi）毛和內被毛。再往裏看，有皮層，內膜和包含DNA的核心。孢子外殼約占孢（bāo）子（zǐ）體積的50%，包（bāo）含約80%的孢子蛋白質，因此構成代謝功能損傷的屏障(例如酶)。

孢子對殺菌劑產生抗性的主要因素似乎是孢子的外殼(Komanapali和Lau, 1996;Young and Setlow, 2004)。Kim等人(2003)的TEM顯微照片也支持了（le）這一觀點，在水氧化處（chù）理（lǐ）的（de）情況下，TEM顯微照片（piàn）顯示了對表層以及外（wài）層和（hé）內層的損害。這種損傷為O3在皮層上的作用開辟了道路，很（hěn）終通（tōng）過細（xì）胞內損傷導致孢（bāo）子失活(Kim et al.， 2003;Young and Setlow, 2004)。

此外（wài），Foegeding(1985)發現，蠟樣芽（yá）孢杆菌的外殼蛋白被去除後，在水溶液中比完整的（de）孢子更快（kuài）地失活:他（tā）們得出結論，孢子的（de）外（wài）殼是對抗O3分子的主要保（bǎo）護屏障。更廣泛地（dì）說，化學脫（tuō）去的孢子和（hé）外殼有缺陷的孢子(結果來自主要外殼形成蛋白cotE的突（tū）變)被水溶液O3殺死的速度（dù）要比外（wài）殼完整的孢子快得（dé）多(Young和Setlow, 2004)。這使得Young和Setlow(2004)得出結論，孢子外（wài）殼(特別是在（zài）萎縮芽孢杆菌孢子中)在孢子對O3的抗性中是必不可少（shǎo）的。膜也（yě）會被氧化劑破壞，包（bāo）括O3 (Cortezzo et al.， 2004)。很（hěn）近的（de）研究結果表明，孢（bāo）子內膜可（kě）能是O3致死性（xìng）損傷的部位，因為（wéi）受損的內膜:

(i)阻止孢子在正常模式高溫熱處理或其萌發形（xíng）式麵臨滲透脅迫（pò）時（shí）保持完整性;

(ii)因為它變得更具有（yǒu）滲透性。Cortezzo等人(2004)進一步研究發現，氧化劑（jì）對孢子內膜的破（pò）壞也與觀察到的甲胺更（gèng）快地滲透到處理過的孢子核心一致:內膜可能是甲胺進入孢（bāo）子核心（xīn）的關鍵滲透性（xìng）屏障。這一滲透性屏障的破裂可能導致孢子核心內（nèi）容物的釋放(Khadre和（hé）Yousef, 2001;Young and Setlow, 2004)。

為了深入了（le）解臭氧暴露後微生物的失活機製，我們首先（xiān）使用幹燥的氣態臭氧，這是（shì）一個比潮濕的（de）氣態臭氧更不複雜的化學環境:

在氣態臭氧中加入水蒸氣會（huì）帶來額外（wài）的氧化（huà）劑，使（shǐ）確定它們的相對貢獻和確定失活機製變得更加困難。本文通（tōng）過（guò）存活曲線研究了（le）細（xì）菌孢子在嚴格幹燥臭氧條件下的inac活化動力學，並利用掃描電鏡 (SEM)檢（jiǎn）查了相應的損傷。還介（jiè）紹了（le）暴露於加濕（shī）臭氧的孢子的這種特征數據。利用文獻資料，對（duì）這兩組實驗結果(幹臭氧和濕臭氧情況)進行密切的“不同”分析，使我們能夠提出一幅新的更詳細的圖片，說明細菌孢子在臭氧作（zuò）用（yòng）下的失活機製。

材料與方法

由於臭氧具有很強的氧化能力，它能或（huò）多或少地破壞各種材料。為（wéi）了盡量減少這種可能的影響（xiǎng），這可能會幹擾（rǎo）我們的（de）實驗，滅菌室由（yóu）316不鏽鋼製成(要求（qiú）承受加濕臭氧)，用（yòng）於光譜觀察的窗戶由熔融二氧化矽製成。待調（diào）查的微生物沉積在由聚苯乙（yǐ）烯（xī）(幹（gàn）臭氧暴露)或耐（nài）熱玻璃(濕臭氧暴露)製成的培養皿上。

臭氧化係統（tǒng）

圖1顯示了用於產生臭氧並在臭氧進入和離開（kāi）腔室時測定其濃度的係統的各種元件。

該腔（qiāng）室由316不鏽鋼製（zhì）成，是一（yī）個（gè）400毫米長，100毫米高，220毫米寬的平行六麵體（tǐ）(6升（shēng）體積)。

臭氧（yǎng）濃度可（kě）以用基於紫外線吸收的分析儀來監測。

生成的廢水也可以通過（guò）FTIR光譜進（jìn）行分析:來自Thermo Nicolet的Avatar 370光譜儀使用DTGS (7800-375 cm-1)探測器，掃描次（cì）數和分辨率分別設置為80和1 cm-1。

臭氧發（fā）生器在氣相中提供分子氧和原子氧的混合物;

它（tā）在電流範圍內工作（zuò），在電流範圍（wéi）內增加臭氧濃度。

臭氧流是幹燥的，因為發生器是由(高純度)O2幹（gàn）氣瓶提（tí）供的。

本文所用的“幹臭氧”一詞是指相對濕度(RH)小於約2%(用濕度計測（cè）定)的氣態臭（chòu）氧。

總氣體流量設定為5.64標準升（shēng）/分鍾（zhōng）(slm)，在幹燥條（tiáo）件下實現臭氧濃度為4,000 ppm。

在工藝線（xiàn）的末端安裝了（le）一個臭氧破壞者，用於減少（shǎo）臭氧並將其作（zuò）為O2釋放，以符合安全(毒性)法規。

出於（yú）安全考慮（lǜ），該腔室也位（wèi）於通風（fēng）櫃內，並連接了真空幹泵，以（yǐ）確保在過程結束時腔室流出物被完全排出。

在使用加濕臭氧（yǎng）的（de）過（guò）程中可以加入水蒸氣。

水通（tōng）過蠕動泵送到“烤箱（xiāng）”(加熱（rè）器)，產生（shēng）的蒸汽被進入的O2氣流驅動到O3管線。

在給定的加熱器溫度和給定的O2流（liú）量下，注入的水蒸（zhēng）氣量取決於（yú）蠕動泵設定的H2O流量。

在單（dān）獨存在O2的情況（kuàng）下，用濕度計(Kahn, Wethersfield, CT, USA)測定腔內相應（yīng）的（de）RH水平（píng）(RH可精確（què）測量至少95%(0.3%))。

在加濕條（tiáo）件下（xià），總氣體流量設置為2.6 slm，以實現約4 000 ppm的臭氧濃度。

腔內氣體溫度保持接近環境溫度(≈22℃)。

總（zǒng）結與結語

了解暴（bào）露於加濕氣體臭（chòu）氧導致的（de）微生物失活機製是一項複雜而艱巨的任務。我（wǒ）們的方法是，在嚴格的幹燥氣體臭氧暴（bào）露(RH, 2%)下（xià），檢查三種生物（wù）指示孢子和一種細菌的失活動力學和形態損傷，然後考慮濕化氣體臭氧暴露的情況:很後，將這兩項（xiàng）研究的結果相（xiàng）關（guān）聯，有助（zhù）於揭示各種（zhǒng）失活機製。

在幹燥的氣態臭氧暴露下，我（wǒ）們已經證明O3分子可以有效地滅活某些類型的孢子(G. stearothermophilus)，而其他類型的孢（bāo）子(B. atrophaeus)則更少，滅（miè）活（huó）率的差異可能在於其成（chéng）分的性質或排列，本質上（shàng）是其外（wài）殼（ké）(和內膜)的化學成（chéng）分。孢（bāo）子的形態不（bú）受（shòu）幹臭氧處理的影響（xiǎng），這（zhè）意味著擴散/氧化，而不是侵蝕，與O3分子的作用有關，這些分子在孢子內移動。

此外，我們還表明（míng），沉積在不同聚合物基質上的孢子的臭氧滅活效果取（qǔ）決（jué）於聚合物的性質。

在（zài）加濕的氣態臭氧暴露下，我們認為（wéi）一個重要的初始機製（zhì）(在殺生物作用（yòng）之前)是孢子的水膨脹，這打開了“通道（dào）”，促進了殺生物劑的內部擴散（sàn）。

這些是O3分子及其與H2O相互作用的副產物，產生高度氧化的物質，如HO.2, OH。過氧化氫。這些（xiē）氧（yǎng）化過程的很終結果是（shì）在一定程度上抵抗幹臭氧作用的孢子(b.s atrophaeus)失活，在足夠長的暴露時間後（hòu），這裏（lǐ）使用的所有三（sān）種生物指示劑都被嚴重破（pò）壞，甚至粉碎。O3分子和氧化（huà）自由基對濕化臭氧失活過程的相（xiàng）對貢獻可（kě）以在未來的（de）工作中確定。下一步（bù）可能（néng）是呼籲分子生物學來評估孢（bāo）子核酸所遭受的損害的種類和程（chéng）度。

正在進行涉及臭氧（yǎng）和表麵淨化的進一步工作。它（tā）涉及的事實（shí）是，通過將某些聚合物置於（yú）幹燥的臭（chòu）氧流(通常為4000 ppm 1小時)中，可以賦予其生物（wù）殺滅性能。然後，當在這些處理（lǐ）過的表麵上沉積（jī）細菌孢（bāo）子時，同一天或2-3天後，並（bìng）讓它（tā）們幹燥24小（xiǎo）時，觀察到初始種群減少3到（dào）5對數(Mahfoudh等人，2010;Mahfoudh et al.， 2010)。