低濃度臭氧控製紅蘋果李斯特（tè）菌的有（yǒu）效性研究（jiū）

        本研究（jiū）旨在探討低劑量連（lián）續臭氧氣體對紅冠蘋果長期商業冷藏過（guò）程中無害李斯特菌和品質屬性及病害（hài）的控製效果。Red Delicious 蘋（píng）果以 ∼6.2 log 10 CFU/蘋（píng）果接種三株無害乳杆菌混合物，用或不用 1-甲（jiǎ）基環丙烯處理，然後（hòu）在商業環境中用或不用連續氣態臭氧進行受控氣氛 (CA) 儲存設施 36 周。將經受上述儲存條件（jiàn）的未接種（zhǒng）紅美味蘋果（guǒ）用（yòng）於酵（jiào）母/黴菌計數和（hé）質量屬性評估。36 周的（de）冷凍空氣 (RA) 或 CA 儲存導（dǎo）致約 2.2 log 10 CFU/蘋果減少無害乳杆菌。與（yǔ）單（dān）獨的 RA 和 CA 存儲（chǔ）相比，臭氧氣體（tǐ）的（de）應用導致無害（hài）乳杆菌的額外 > 3 log 10 CFU/蘋果減（jiǎn）少。在 36 周的 CA 儲存過程中，連續施用低劑量（liàng）的（de）氣態臭氧顯著延（yán）緩（huǎn）了酵母/黴菌的生長，延緩了蘋果的硬度損失，並且對臭（chòu）氧燃燒、皮孔腐爛、赤褐色、CO 2損傷、表麵燙傷、與單獨 CA 存儲相比，Red Delicious 蘋果的軟燙。總之，連續應用低劑量（liàng）氣態臭氧有可能控（kòng）製紅美味（wèi）蘋果上（shàng）的李斯特菌，而不（bú）會對蘋果的（de）品質屬性產生負麵影響。

介紹

        單核細胞增生李斯特菌（jun1）可在易感人群中引起致命的李斯特菌病，並且死亡率很（hěn）高（CDC，2017）。單核細胞增（zēng）生李斯特菌廣泛存在（zài）於農業環境中。美國食品和（hé）藥（yào）物管理（lǐ）局對蘋果和其他即食食品實（shí）施零（líng）容忍（Shank 等人，1996 年；FDA，2008 年）。蘋果在開放（fàng）環境中生長，因此在生產或隨（suí）後的采後包裝（zhuāng）過程（chéng）中可能受到單核細胞增生李斯特菌的感染（ Angelo 等人，2017 年）。單核細胞（bāo）增生（shēng）李斯（sī）特（tè）菌與兩（liǎng）次多（duō）州焦糖蘋（píng）果暴發有關（Angelo 等人，2017 年；Marus 等人，2019 年）) 以及多個新鮮蘋果品種 ( FDA, 2017 , 2019 ) 和（hé）鮮切蘋果 ( FDA, 2016 , 2020b ) 的多次召回。這些暴發和召回（huí）凸顯了蘋果李斯特菌汙染（rǎn）的風險以及控製蘋果李斯特（tè）菌的重（chóng）要性。收獲後，蘋果通常在受控氣氛 (CA) 冷藏庫中冷藏長達 12 個月。在這種長期儲存過程中進行抗菌幹預可以（yǐ）為控製新鮮（xiān）蘋果上（shàng）的李（lǐ）斯特菌提供潛在的幹預策略（ Sheng 和 Zhu，2021 年）。

        臭氧是一種強氧化（huà）劑和強效（xiào）抗菌劑，不會在處理過的產品上留下任（rèn）何（hé）殘留物（Guzel-Seydim 等（děng）人，2004 年）。臭氧氣體被食品和藥物（wù）管理局批準為公認安全（quán）劑（FDA，2020a），並被批準用於有機生產和處理（USDA-NOP，2021）。已經（jīng）研究了以固定速率在短（duǎn）時間內控製主要（yào）食源性病原體的氣態臭氧，包括大（dà）腸杆菌O157:H7（Han 等人，2002 年）、沙門氏菌（Das 等人，2006 年）和單核細胞增生（shēng）李斯特菌（Alwi 和 Ali，2014 年；Concha-Meyer 等人，2014 年) 新鮮農產品。例如，10 mg/L 的臭（chòu）氧氣體可在1 小時內使番茄上接種的腸炎沙門氏菌減少約 7 log 10 CFU/番茄（qié）（Das等人，2006 年）。在 4°C 下儲存 10 天後，新鮮（xiān）藍莓上的 4 mg/L 氣態臭氧可將單核細胞增生李斯（sī）特菌減少 3 log 10 CFU/ml（ Concha-Meyer 等人（rén），2014 年（nián））。20 分鍾的氣態臭（chòu）氧 (23 mg/L) 暴露導致帝國蘋果上單核細胞增生李斯特菌的 2.1–3.1 log 10 CFU/蘋果減少（Murray 等人，2018 年）。還研究了臭氧氣（qì）體以控製不（bú）同蘋果品種在儲存期間的常駐（zhù）微生物群（Yaseen 等，2015）。在（zài） 1°C 儲存條件下，暴露 0.5 mg/L 的臭氧氣體 60 天會導致新鮮蘋果上的擴展青黴減少 2.7-4.0 log ，具體取決於品種（Yaseen 等（děng）人，2015 年）。

       此外，在儲（chǔ）存期間（jiān）使用臭氧氣體有利於保持水果品質（zhì）。例如，據（jù）報道，1-3 毫克/升的（de）臭氧暴露可保持蘋果的硬度（Antos 等人，2018 年）並（bìng）減少蘋果的重量損失（Juhnevica-Radenkova 等人，2019 年（nián））。我們之前表明，在 CA 儲存中連續應用 30 周 87 μg/L 的氣態臭氧可（kě）將富士蘋果上李斯特菌（jun1）減少 5.0 log 10 CFU/蘋果（guǒ），而不會對蘋果果實質量產（chǎn）生負麵影響。盛等人，2018）。然而，這種影響不能直接轉移到其他蘋果品（pǐn）種（zhǒng），因為每（měi）個蘋果品種都有其獨特（tè）的表皮蠟和常（cháng）駐微生物群組成，這些成分會影響李斯特菌（jun1）的持（chí）久性和對（duì）抗菌幹（gàn）預的反應（Chai 等人，2020 年；Ku 等人，2020 年；Abdelfattah 等人）等，在新聞中）。

        Red Delicious 蘋果是美國很暢銷（xiāo）的蘋果品種之一（USAA，2019 年），很近因（yīn）潛在的單核細胞增生李（lǐ）斯特菌汙（wū）染而被（bèi）召回（huí）（FDA，2019 年）。與其他商業化種植的蘋果品種相比，Red Delicious 蘋果特（tè）別容易出現水核，在長期 CA 儲存（cún）期間發生內部疾病（例如內部褐變）的風險增加（Mattheis，2008 年），進一步導致蘋果產業遭（zāo）受損失。本研究的目的是研究不同（tóng）商業儲存方式與不同（tóng）劑量的連續氣態臭（chòu）氧在控製無害李斯特菌方麵的效（xiào）果，在有或沒有 1-甲基環丙烯 (1-MCP) 預處理（lǐ）的 Red Delicious 蘋果上與（yǔ）L. monocytogenes ( Buchrieser et al., 2003 ) 在係統發育上相關。進（jìn）一步評價了紅冠蘋果在不同貯藏條件下品質屬性的維持情況。

材料和方法

無害李斯特菌培養準備

        兩種L. innocua 食品分離物，NRRL 33314 和（hé） NRRL 33554，以（yǐ）及一種（zhǒng）加工廠分離物L. innocua，NRRL 33197，來自 USDA-ARS 培養（yǎng）物保藏中（zhōng）心 [National Center for Agriculture Utilization Research (NRRL), Peoria, IL, United州] 並儲存在添加 0.6% 酵母提取物 (TSBYE；Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, United States) (TSBYE) 和 20 -80°C 下的 % (v/v) 甘油（yóu）。每個冷凍培養物在 TSBYE 中在 37°C 下連續轉移兩次 24 小時。通過組合等量的單個（gè）L. innocua菌株來製備三菌株雞尾酒接（jiē）種物。個體L. innocua通過在 TSAYE（含 1.5% 瓊脂的 TSBYE）板上連續稀釋和鋪（pù）板來計（jì）數菌株或三菌株混合（hé）物。

蘋果接種

        新鮮未上蠟的紅美味蘋（píng）果，在商業成熟時手動收獲（huò），康奈爾澱粉（fěn）指（zhǐ）數顯示範圍（wéi）為 2.8-3.5（Blanpied 和 Silsby，1992 年），儲存在商業儲藏室（亞基馬，華盛頓（dùn）州（zhōu），美國），溫度為 ∼ 1°C 並在研究前送到實驗室（shì）。本研究選擇了沒有（yǒu）割傷、瘀傷或（huò）疤痕的蘋果（~200 克）。對於L. innocua接（jiē）種，將蘋果浸入在無菌磷酸鹽緩衝鹽（yán）水（shuǐ）（1 × PBS，pH 7.4）中稀釋的三株L. innocua接種（zhǒng）物中，以獲得約 6.2 log 10的接（jiē）種水（shuǐ）平CFU/蘋果。接種（zhǒng）後的蘋（píng）果在室溫（~22°C）下放（fàng）置（zhì） 24 小時，然後進行相應的（de）儲存。分別在 0 和 24 小時隨機抽取 40 個接種蘋果，以確認初始細菌水（shuǐ）平和接種的均勻（yún）性。

蘋果的貯藏（cáng）處理

        接種後 24 小時的（de）蘋（píng）果被隨（suí）機裝入塑（sù）料箱中；每箱 40 個蘋果。將盒裝（zhuāng）接種過的蘋果（guǒ）隨機分成6組，其中一半在貯藏前用1.0 mg/L 1-MCP氣態空（kōng）氣處理24 h。然後將蘋果置於冷凍空（kōng）氣（qì） (RA; 0.2 ± 0.1°C) 和 CA (0.2 ± 0.1°C, 3.1 ± 0.0% O 2 , 0.4 ± 0.0% CO 2 ) 中，有或沒有 60.2 ± 5.7 或78.7 ± 13.2 μg/L 在半商業 RA/CA 房間（3,200 ft 2）在商業設施（Stemilt Growers LLC，Wenatchee，WA，United States）中的相對濕度約為 90%。臭氧氣體（tǐ）由（yóu）商用臭氧發生器產生，並通過（guò）比例（lì）-積分-導數算法自動轉移到儲（chǔ）存室，以（yǐ）在儲存期間（jiān）將（jiāng）臭氧劑量保持在目標水平。臭氧濃度在儲存的第一周開始，在第四周開始時達到目標濃（nóng）度。同時，分離（lí）的未（wèi）接種蘋果組被包括在上述儲存條件中，用於居民微生物區係計數和蘋果（guǒ）品質評價。

        接種後的蘋果在儲存 3、6、12、18、24、30 和 36 周後取樣，用（yòng）於L. innocua計數。在儲存 6、12、24 和 36 周後對未接（jiē）種的蘋果（guǒ）進行取樣，以（yǐ）測定總平板計數 (TPC) 和酵母/黴菌計數（shù）。蘋果質（zhì）量屬性在收獲時和儲存 6 個月（yuè）和 9 個月（yuè）時進行評估。每個貯藏（cáng）條件下每個時間點取樣 40 個蘋果用於微生（shēng）物計數、質量屬性和內部紊亂評價，而每個貯藏條件下每（měi）個（gè）時（shí）間（jiān）點（diǎn）采樣 100 個蘋果用於（yú）外（wài）部紊亂評價，其中每個蘋果（guǒ）被視為一（yī）個實驗單元。

無害李斯特菌枚舉

將（jiāng）每個蘋果轉移到裝有（yǒu） 10 ml 無菌（jun1） 1 × PBS 的（de）胃袋（Fisher Scientific）中，並用手（shǒu）揉搓 80 秒。摩擦溶液用無菌 1 × PBS 連（lián）續稀（xī）釋 10 倍，鋪在 TSAYE 板（bǎn）上，然後（hòu）覆蓋改性牛津（jīn）瓊脂 (MOX) (BD) 以（yǐ）區分李斯特菌（jun1）和背景細菌（Shen 等人，2019 年），並在37°C 48 小時。L. innocua在 MOX 瓊脂平板上產生典（diǎn）型的黑色菌落，周圍（wéi）有黑色暈圈。對於低於檢測限（10 CFU/蘋果）的樣品，將 1.0 ml 摩擦溶液在（zài）緩（huǎn）衝的李斯特菌富集緩衝液 (BLEB) (BD) 中在 30°C 下富集 48 小時；李斯特菌（jun1）的存在/不存在已經報（bào）道。將富集培養物分別劃（huá）線到 MOX 和 CHROMagar TM 李斯特菌（CHROMagar，Paris，France）平板上，以（yǐ）定性檢測李斯特菌的存在（zài）（Sheng 等人，2017 年）。在每個（gè）時間點，每個存儲方案的樣（yàng）本大小為每次複製 10 個蘋果，每個存儲（chǔ）方案有（yǒu）四個獨立的複（fù）製。

居民微生物群計數

未接種蘋果的處理方式與接種蘋果相同。將適當稀釋度的摩擦（cā）溶液分別鋪（pù）在（zài）重複的 TSAYE 板和馬鈴薯葡萄糖瓊脂 (PDA; BD) 板上，用於（yú） TPC 和酵母/黴（méi）菌（jun1）計數。TSAYE 板在 37°C 下孵育 24 小時，而 PDA 板在室溫 (22°C) 下孵育 5 天。在每個時間點，每（měi）個存儲方案（àn）的樣本大小為每次複製 10 個蘋（píng）果，每個存儲方案有四個獨立的複製。

水果品質分（fèn）析（xī）

根據已發表的方法，在收獲時以及冷藏後 6 個月和（hé） 9 個月時對未接種蘋果的果實質量屬性（包括（kuò）硬度、總可溶性固形物 (TSS) 和可滴定酸度 (TA) 進（jìn）行了評估（Sheng 等人，2018 年）。簡而言之，使用水果（guǒ）質地分析儀（FTA GS-15-643，Güss Manufacturing，Ltd.，Strand，南非）在去皮區域（~3 cm 2) 在每個蘋果的陽光照射和陰影（yǐng）麵（miàn）。TSS 含量使用 Atago PR-32 數字糖度折光儀（Atago Co., Ltd., Tokyo, Japan）測量。果汁的 TA 表示為蘋果酸含量的百分比（每 100 克（kè）蘋果鮮（xiān）重的蘋果酸克數），並使用電位滴定儀（yí）（Titrando 888 和 875 Robotic USB Sample Processor XL, Metrohm, Riverview, FL, United狀態）。蘋果質量分析使用了每次重複 10 個蘋果的樣本量，每個存儲（chǔ）方案有四個獨立的重複。

水果障礙分析

在收獲時和冷藏 6 個月和 9 個月後檢查水果是否有外部疾病。外部（bù）疾病包括（kuò）臭氧燒傷（蘋果（guǒ）暴露側的表（biǎo）麵凹坑）、表麵（miàn）燙傷（皮膚上的棕色斑塊和變色）、皮孔腐爛（皮孔周圍的深棕色（sè）凹坑）、腐爛（可（kě）見的菌（jun1）絲體（tǐ）或孢子團）、赤褐色（在皮膚）和 CO 2損傷（皮膚上的雪（xuě）花樣斑塊）按照（zhào）先前描述的標準標準進（jìn）行目視檢查（Sheng 等人（rén），2018 年）。軟燙傷，特征是蘋果表麵有光滑或不規（guī）則形狀的棕色損（sǔn）傷（shāng）（DeEll，2013)，也進行了評估（gū）。蘋果被切片 3 次，用於評估內部疾病，包括水核和內部褐（hè）變。Watercore 的特點是富含山梨糖醇的液體在與脈管（guǎn）係統相鄰的肉的細胞間隙中積聚（Marlow 和 Loescher，1984 年）。內部褐變的特征是通（tōng）常起源於核心區域附近的（de）果肉變褐色（Argenta 等，2001）。結果報告（gào）為每個貯藏（cáng）期（qī）內單獨處理（lǐ）中的蘋果與各自的無序/總蘋（píng）果 (%)。內（nèi）部（bù）紊亂評估使用每個重複 10 個蘋果的樣本大小，每個儲存方案有四個獨立重複。對於外部（bù）紊亂評估，每（měi）個存儲方案（àn）使用 100 個蘋果的樣本大小。在室溫 (22°C) 下 1 天和 7 天後對蘋果進行評估。

統計分（fèn）析

使用 IBM SPSS 19.0 (Chicago, IL, United States) 分析數據。通過單向方差分析 (ANOVA) 識別（bié）平均（jun1）差異，然後進行（háng） Tukey 多重比較測（cè）試。p < 0.05 的值被認為（wéi）具有統計學意義。

圖（tú）所示。紅鮮蘋果商業（yè）冷藏36周（zhōu）內無（wú）毒蜱的存活（huó）研究。a - cMean在沒有公共字（zì）母的（de）各采樣點上差異顯著(p < 0.05)。平均值±SEM, n = 32-40。MCP，蘋果在冷藏前用1-MCP處理;CAHighO3, CA儲存，氣體O3持續施加在78.7±13.2 μg/L;CAMCPHighO3, CA儲存時連（lián）續施加氣體O3(78.7±13.2 μg/L)，冷藏前用1-MCP處理蘋果;CAMCPLowO3, CA儲存時連（lián）續施（shī）加氣體O3(60.2±5.7 μg/L)，蘋果在冷藏（cáng）前用1-MCP處（chù）理。

圖在商業冷藏的36周內，紅（hóng）美味蘋果上的駐留細菌。a,b不帶公共字母的各采樣點均值差異顯著(p < 0.05)。均值±SEM, n = 40。MCP，蘋果在冷藏前用1-MCP處（chù）理;CAHighO3, CA儲存，氣體O3持續施加在78.7±13.2 μg/L;CAMCPHighO3, CA儲存時連續施加氣體O3(78.7±13.2 μg/L)，冷藏前用1-MCP處（chù）理蘋（píng）果;CAMCPLowO3, CA儲存時連續施加氣體O3(60.2±5.7 μg/L)，蘋果在冷藏前用1-MCP處理。

結論

經過 9 個月的商業 RA 或（huò） CA 儲存，Red Delicious 蘋果上的無害乳杆菌計數（shù）減少了 ~2 log CFU/蘋果。在60.2–78.7 μg/L 的連續低劑量臭氧氣體處理下，無害（hài）乳杆菌的減少量增加了 1,000 倍；> 5.0 log 10 CFU/蘋果在儲存 24 周後減少。此外，與無臭（chòu）氧氣體的 CA 儲存（cún）相比，在 CA 儲存中應用低劑量氣態臭（chòu）氧可延緩常駐微生物群的（de）生長，延緩蘋果硬度損失，改善蘋果品質，並且對 Red Delicious 蘋果的外部（bù）疾病（bìng）沒有負麵影（yǐng）響。因（yīn）此，低劑量的連續氣態臭氧應用（yòng）是（shì）蘋果行業控製（zhì）李斯特菌的一個有前景的策略。和 Red Delicious 蘋果上的微生物（wù）腐爛。需要進一步研（yán）究不同臭氧用量和蘋果品種，以（yǐ）確保新鮮蘋果（guǒ）的安全和質量（liàng）。