不（bú）同消毒劑對禽舍細菌氣溶膠多樣性的影響

        為了更好地了解不（bú）同消（xiāo）毒劑對肉雞舍微生物種類和（hé）數量的影（yǐng）響，使用了臭氧、有效氯、季銨鹽、戊二醛和混（hún）合消毒劑等五種不同類（lèi）型的消毒（dú）劑。通過高通量測序（xù）結（jié）合空氣采樣分析（xī）肉雞舍微生物群落。結果表（biǎo）明，與未使用消毒（dú）劑的雞舍相比，施用不同消毒劑的空雞舍空氣中需氧菌濃度顯著降低（P < 0.05或P< 0.01), 消毒後可吸（xī）入空氣中需氧菌顆粒數急劇下降。在五種消毒劑中，混合消（xiāo）毒（dú）劑對總微生物群落的消毒效果很好（P < 0.05）。高通量測序（xù）共獲得508143個高質量序列（liè），確定了1995個可操作（zuò）的分類單元。總共鑒（jiàn）定出 42 個門和 312 個屬（shǔ）。施（shī）用不同消毒劑後肉（ròu）雞舍內空氣中微生物群落結構不同。在混合消毒劑處理的房屋中，微生物群落中含有機會致病菌，如大（dà）腸杆菌、誌賀氏杆菌、芽孢杆菌和假單胞菌，豐（fēng）度很低，與（yǔ）未經消毒（dú）劑處理（lǐ）的房（fáng）屋相比，豐度顯著（zhe）降低。α多樣性（xìng）指（zhǐ）數顯示，混合消毒劑處理（lǐ）的雞舍內微生物群落多樣性較低。與其他四種消毒劑相比，混合（hé）消毒劑處理過的房屋的空氣樣本中僅檢測到（dào）少量細菌；具體來說，隻發現了四個門（變（biàn）形菌門、擬杆菌門、放線菌（jun1）門（mén）和厚壁菌門）。混合消（xiāo）毒劑對四個門類的消（xiāo）毒產生了積極的影（yǐng）響；但是，它並沒有徹底消除它們。在屬水平上，芽孢杆菌屬、Arenimonas和Shinella用混合消毒劑處理過的（de）雞舍檢測不到，用其他消毒劑處理過的雞舍檢測到。高通量（liàng）測序結果（guǒ）表明，多種消毒劑聯（lián）合使用具有良好的消毒效果，該技術可以對肉雞舍的空氣（qì）進行消毒（dú）。這些結果（guǒ）將（jiāng）有助於指導製定（dìng）合理的肉雞舍消毒方案。

介紹

近年來，隨著畜牧（mù）業和（hé）養殖業集約化程度的（de）不斷提高，圈養動物的密度不斷增加。此外，動物傳染病的傳播（bō）正在加速（sù），各種動物流行病已（yǐ）經出現（Wu et al., 2012 ; Mellata, 2013 ; Mughini-Gras et al., 2014 ; Threlfall et al., 2014 ; Barbosa et al. ，2017 年；Poulsen 等人，2017 年；Stromberg 等人，2017 年；Vinayananda 等人，2017 年）。因此（cǐ），畜禽舍的（de）消毒已成為（wéi）防治（zhì）疾病的重要措施。肉雞舍常用的化學消毒（dú）劑包括有效氯、臭氧、季銨鹽和戊二醛（Meroz 和 Samberg，1995 年；Saklou 等人，2016 年；Chidambaranathan 和 Balasubramanium，2017 年）。用於肉雞舍大規模（mó）消毒的（de）不同消毒劑作用機製（zhì）不同，因此其消毒效果也（yě）不同（Suwa et al., 2013 ; Chidambaranathan and Balasubramanium, 2017 ; Maertens et al., 2017））。目（mù）前，含氯化合物（二（èr）氯異氰尿酸鈉、次氯酸鈉、漂白（bái）粉、二氧化氯等）廣泛用作（zuò）畜（chù）禽生產中的（de）消毒劑（Van Klingeren，1995；Boxall等，2003）。有效（xiào）氯能有效殺滅結核（hé）杆菌、腸杆菌、腸球菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌。低濃度的尼日爾孢子（Boxall 等人，2003 年；Hakuno 等人，2010 年；Suwa 等人，2013 年）。

        許多研究表明，含氯化合物可以通過改變微生物的細胞膜（mó）結構來殺死微生物（Venkobachar et al., 1977 ; Virto et al., 2005 ; Liu et al., 2006 ; Berg et al., 2010）。臭氧是一種三原子氣態分子，可作為強氧化劑，已在醫學中使用了 150 多（duō）年（Elvis 和（hé） Ekta，2011 年）。臭氧因其有效的抗菌功（gōng）能 ( Ozturk et al., 2017 ) 和抗（kàng）氧化防禦 ( Delgadoroche et al. , 2017) 而具有廣泛的醫療應用）。革蘭氏陰性菌比革（gé）蘭（lán）氏陽性菌對臭氧更敏感，而細菌比測試過的酵母菌株更敏感（Moore 等人，2000 年）。雅各布斯和（hé）海德堡 (1915)首次合成具有殺菌能（néng）力的季銨鹽化合物。季銨（ǎn）鹽的殺菌機製涉及改變細胞通透性，導致細菌內容物外滲。季（jì）銨鹽是一種陽離子表麵（miàn）活性劑（jì）。鑒於（yú）陽（yáng）離子表現出（chū）基於親脂性的殺菌作（zuò）用，並且革蘭（lán）氏陽性菌的細胞壁比革蘭氏（shì）陰性菌含有更多的脂質，因此革蘭氏陽性菌更容易被季銨鹽滅活。戊二醛可（kě）以直接作用於細菌（jun1）的（de）蛋白質（zhì）和（hé）酶，從而影響細菌的新（xīn）陳代謝，導致細菌死亡（wáng）。戊二醛還可以防止細菌孢子外層釋放二鹽（yán）酸鹽，防止孢子形成。所以，Battersby 等人，2017 年；卡斯特羅（luó）等人（rén），2017 年）。戊二醛殺菌譜廣，對細菌和病毒具有（yǒu）高效殺滅能力。戊（wù）二醛對梭狀芽孢杆菌產（chǎn）生的孢子也有很強的（de）作用，可引起（qǐ）壞死性腸炎，因此常用於流行病期間細菌孢子的消毒（Miner et al., 1993 ; Rutala et al., 1993 ; Brantner et al . ., 2014 年）。

        在集約化養殖過程中，家畜和家禽可以通過糞（fèn）便和呼吸道排出細菌和病毒，包括機會性病原體，並在（zài）空氣中產生生物氣溶膠（jiāo），可能危害人類和環境（jìng）（Hojovec 和 Fiser，1968 年（nián）；Bessarabov 等人， 1972 年；Petkov 和 Tsutsumanski，1975 年；Petkov 和 Baĭkov，1984 年；Petkov 等人，1987 年；Just 等人，2011a，b）。雞被轉移或淘汰後，空的肉雞舍受到不同程度的汙染。空屋（wū）消毒是規模化養雞場（chǎng）防治疾病的（de）重要一步。消毒可以減（jiǎn）少或殺死雞舍內潛在的病（bìng）原微生物，防止病原微生物在批次間傳播。不同的消毒程序有不同（tóng）的效果，因此選擇合適（shì）的消毒劑以及消毒程（chéng）序和方法可以有（yǒu）效控製禽舍傳染病的發（fā）生。這些方（fāng）法主要包括清洗、浸（jìn）泡、熏蒸、噴塗和紫外線照射。霧化消毒劑已經應用（yòng）了半個多（duō）世紀。氣溶（róng）膠可以節約材料，形成消毒氣溶膠（jiāo）-消毒劑蒸氣係統（Wichelhaus 等人，2006 年；卡瓦（wǎ）略等人（rén），2015 年；Saklou 等（děng）人，2016 年）。應用超聲霧化技術，可將液體霧化成氣溶膠狀態（tài），獲得（dé）均勻分散（sàn）的2~4 μm液滴。霧化後的液滴起到“種子粒子”的作用（yòng），在氣溶膠中形成聚集（jí）核，可以與周圍的細小顆粒有效（xiào）碰撞，提（tí）高聚集效率。消毒劑霧化後，空氣中散發出大量水蒸氣，增（zēng）加室內相對濕度（dù），提高消毒劑對細菌壁的（de）滲透能（néng）力，增強消毒效果，減少（shǎo）消毒時間（Muñoz等., 2017 年）。

        理想的消毒劑應具有良好的殺滅病原微生（shēng）物的能力；性質穩定（dìng），不易（yì）受水質、有機物等物理化學因素的影響；有效控製養雞場環境衛生。因此，檢測（cè）空屋消毒後殘留的微生物是評價（jià）消（xiāo）毒（dú）效果（guǒ）的重要手段。許多方法可用於微生物氣溶（róng）膠檢測，例如微生物（wù）培養計數、直（zhí）接顯微檢（jiǎn）測、生物傳感器技（jì）術和（hé）基（jī）因芯片技術。這些（xiē）方法是傳統的，無法準確檢測不易培養或空氣中含（hán）量低的微生物。高（gāo）通量 DNA 測序方法可用於通過 16S rRNA 序列（liè）分析（xī）來表征微生物係統。(Korajkic 等人，2015 年；賈等人，2016 年）。該技術的優勢在於能夠檢測培養方法難（nán）以獲得的微（wēi）生物；因（yīn）此，該（gāi）技術已廣泛應用於許多領域（O'Brien et al., 2014 ; Tian et al., 2017）。高通（tōng）量測序技術可用於評估消毒對空屋內微生物分布和微生物群落結構的影響。本研究采用五種常用消毒劑對禽舍進行消（xiāo）毒。通過 16s rRNA 的高通（tōng）量測序分析了處理後存在的（de）微生物群的組成，並與未處理房屋中的微生物群進行了比較。研究（jiū）了不同消毒劑對空置肉雞舍內微生物數量（liàng）和多樣性的影響。本研究（jiū）為消毒（dú）劑在（zài）疾病預防中（zhōng）的（de）正確應用和消毒程序的（de）製定提供參考。

結果與分析

消毒劑處理和未處理的肉雞舍內（nèi）好氧菌（jun1）的含量和粒徑分布

未經處理和用消毒劑處理的肉雞舍中的氣溶膠濃（nóng）度如圖2所示。經過處理的房屋（wū）的（de）細菌負荷低於未經處（chù）理的房屋。經不同消（xiāo）毒劑處理後，有效氯和混合消毒劑處理的肉雞舍細菌氣溶膠濃度很（hěn）高和很低（dī），分別為7.67×10 2 cfu/m 3和0.22×10 2 cfu/m 3。顯然，混（hún）合消毒（dú）劑（jì）對培（péi）養細菌的效（xiào）果優於其他四（sì）種消毒劑（P < 0.05）。

圖 1.未經（jīng）處理和經消毒劑（jì）處理的空氣中的細菌總數 ( n = 9)。A：無需消毒；B：臭氧（yǎng）；C：有效氯；D：季銨鹽；E：戊二醛；F：混合消毒劑。

如表1所示，與未經處理的雞舍相比，經消毒劑處理的（de）肉雞舍中空氣中需氧菌的粒徑分布發（fā）生了顯著變（biàn）化。從 Andersen-6 集塵器的 III-VI 階段開始，用不同消毒劑處理的肉雞舍中空氣中需氧菌的（de）分布有所減少。與未用消毒（dú）劑處（chù）理的空雞舍相比，有效（xiào）氯（lǜ）、季銨鹽、戊二醛和混合消毒劑消毒（dú）的肉（ròu）雞舍在Ⅲ~Ⅵ階（jiē）段的分布顯著降低。在混合消毒劑處理（lǐ）的肉雞舍中，V-VI階段空氣中需氧（yǎng）菌的比（bǐ）例較消（xiāo）毒前的比例（lì）從35.1%顯著下降到0%，戊二醛（quán）從35.1下降到1%。

表 1.未（wèi）經消毒劑處（chù）理和處理（lǐ）過的細菌的分（fèn）級分布。

通過高通（tōng）量（liàng）測序（xù）進行序列分析

在（zài）對空氣傳播（bō）細菌中細（xì）菌 16S rRNA 基因的 V4-V5（515F-907R）區域進行測序後，樣（yàng）本中的原始序列總數為 531,093。過濾低（dī）質量序列後，有效序列總（zǒng）數為508,143。在對序列進行質量控製後，將序列聚類到 OTU 中，以 97% 的（de）同一性進行分類。所有樣本共產生 1995 個 OTU（補充表S1），平均長度為 372 bp。每個樣品的序列信息（xī）如表2 所示。

表 2.樣品的序列信息。

微生物群落結構分析

在微生物分類門水平（圖2A)，未處理或經五種消（xiāo）毒劑（jì）處理的肉雞舍內采集的空氣傳播（bō）微（wēi）生物主要包括變形菌門、擬杆菌門、放線菌（jun1）門和厚壁菌門。這些門經臭（chòu）氧、有效氯、戊二醛和混合消毒劑處理（lǐ）後（hòu）占優勢（shì），相對豐度分別為99.0、97.9、99.8和99.9%。未經消毒劑處理或消（xiāo）毒劑處理（lǐ）的肉雞舍中空氣傳播的（de）微生物在門水平上存在差異。未經處理（lǐ）的雞舍總共有 32 個門，而用（yòng）臭氧、有效氯、季銨鹽、戊二醛和混（hún）合消毒劑處理的肉雞雞舍的門數分（fèn）別為 21、27、28、17 和 6 個（gè）. 使用混合（hé）消毒劑後OTU的相對豐度很低。

圖 2.門水平(A)和屬（shǔ）水平(B)的群落分類組成和豐度分（fèn）布。a、臭氧；b、有（yǒu）效氯；c、季銨鹽（yán）；d、戊二醛；e、混合消毒劑；f、未經消毒。

微生物群（qún）落多樣性分析

采用 Chao1 指數、ACE 指數、Shannon 指數和 Simpson 指數評估樣（yàng）品中微生物物種的豐度和多樣性（xìng）（表3）。不同樣本的多樣性指標不同。未經消毒的肉雞舍的多樣性指數高於其他雞舍的指數，說明未經消（xiāo）毒的肉雞舍的生物（wù）多樣性比較豐富。但經混（hún）合消毒劑處理後，肉雞舍（shě）樣品的Chao 1和ACE豐度指數較其他（tā）樣品有所下降。混合消毒劑的多樣（yàng）性指（zhǐ）數很低，表明其（qí）消毒效果優於其他消（xiāo）毒劑。此外，主（zhǔ）坐標分析（PCoA）顯示各個樣本之間存在明顯的（de）聚（jù）類，來自未處理房屋的樣（yàng）本聚集在一起並與其他處理房屋樣本分離（lí）（補充圖S1）。

表 3.樣品中細菌 α 多樣（yàng）性的統計分析。

聚類分析

基於可在門級別（bié）分類的 35 種不同分類法構建了熱圖（圖3 ）。圖中的每個小方（fāng）框代表樣本中某個細菌門的相對豐度。更強烈的紅色代表增加的相（xiàng）對豐度。如熱圖所（suǒ）示，不同樣品中微生物群（qún）落的組成不同。未經處理的肉雞舍空氣中微生物群落豐度很高，多種（zhǒng）消毒劑聯合（hé）處理（lǐ）後該豐度明顯下（xià）降。

圖（tú）3.門級細（xì）菌的相對豐度。a、臭氧；b、有效氯；c、季銨鹽；d、戊（wù）二醛；e、混（hún）合消毒劑；f、未經消毒。熱圖基於行Z分數進行顏色編碼。比例（lì）尺是六個樣品（pǐn）中（zhōng）細菌相對百分比的標（biāo）準化Z值。顏色代碼表（biǎo）示相對豐度，範（fàn）圍從藍色（低豐度）到黃色到（dào）紅色（高豐度）。